| PPD203 | |
| ID |  PPD203 |
| Project ID | PPD2 [Protein] [PREIMS] |
| Subject | 緑色蛍光タンパク質（GFP）検出用の発光ダイオード（LED）光源 |
| Project Theme | Development of innovative methods to support membrane protein crystallization |
| Principal Investigator | Hiroaki Kato |
| Affiliation | Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University |
| Backgrounds | ・GFPと膜タンパク質を融合して発現させると、試料が結晶化するかどうかなどのスクリーニングに有効 ・特に、種々の電気泳動法を用いると、GFP融合膜タンパク質解析が効率よく行える 電気泳動ゲルを均一に照明でき、GFP検出に最適化された励起用光源があれば、さらに精度と効率が上がる |
| Highlights | ・電気泳動ゲル中のGFPを励起するのに適した照明装置を設計・構築した これにより、従来法よりはるかに高い感度で電気泳動ゲル中のGFPを検出することが可能になり、目的の膜タンパク質の発現量や、電気泳動後の分離状態を、精度よく分析することが可能になった |
| Outline | 膜タンパク質を大腸菌、酵母や昆虫細胞につくらせる際、緑色蛍光タンパク質（GFP）を付加しておくと、GFPの発する蛍光を検出することで、目的試料を精製することなく、微量の試料を用いて発現量を測定できる。さらに、生産された膜タンパク質が、結晶化に適するかどうか（結晶化能）を少ない試料で迅速に判定する（スクリーニング）こともできる。特に、電気泳動法は多くの試料を同時に分析できるため、GFP蛍光検出を利用できると、さらに効率的なスクリーニングが可能になる。 GFPにはいくつかの変異体が存在し、発する蛍光の波長も、蛍光を出させるためにあてる光（励起光）の波長もそれぞれ異なる。なかでも、GFPuv（最大励起波長：395nm）やEGFP（最大励起波長：488nm）は、高い蛍光強度と良好な性状をもつため膜タンパク質のスクリーニングにもよく利用される。我々は、これらの変異体を最も効率よく励起できる波長（最大励起波長）に近い光を発振するLEDを用いた簡便な照明装置を設計・構築した。この照明装置によって生じたGFP蛍光は、適当なフィルターを使用することで、デジタルカメラや記録装置に取り込むことができる。 この照明装置を用いることで、SDS-PAGEなどによるGFP融合タンパク質の電気泳動結果を、これまでに報告されていた透過光装置を用いた照明法と比べ、バックグラウンドが低く高い感度で検出することができる。また、我々は、結晶化能を大きく左右するタンパク質の性状を適確に把握するため、分離能に優れたIn-gel蛍光Native電気泳動法を開発した（Ihara et al., Anal. Biochem., 412, 217, 2011）が、その電気泳動後のゲル中の蛍光を検出する際にも、この照明装置は有効である。 |
| Application | - |
| Article | - |
| CSML File | PPD203.csml |